細(xì)胞凋亡檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)步驟：

1、細(xì)胞DNA 含量分布（ 由細(xì)胞DNA 降解方式檢測(cè)細(xì)胞凋亡） 

    收集已固定的單細(xì)胞懸液約 5× 105~1 × 106/ml；

    離心除去固定液， 3ml PBS 重懸細(xì)胞;

   使用低速離心機(jī) 1500rpm  離心， 5 分鐘 ，棄去 PBS；

   加 PI 染液 1ml，室溫避光 20 分鐘；

   調(diào)整細(xì)胞濃度 5× 105/ml；

   上機(jī)檢測(cè)。

2 、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1)      常 規(guī) 制 備 單 細(xì) 胞 懸 液 ,  用 PBS   洗 兩 次 .(  若 為 全 血 要 先 溶  血),取約 5× 106 個(gè)細(xì)胞，1500rpm 離心,棄上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重懸；

2)   分成 a 、b 、c 、d 、e 五管，每管約 1× 106 個(gè)細(xì)胞

a)    陰性對(duì)照，不加任何試劑；

b)    陽(yáng)性對(duì)照,加 2%多聚甲醛固定 30 分鐘,加 AnnexinV 5μl, 室溫 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,棄上清再加 190μl  緩沖液、10μl PI 避光 15 分鐘

c)    加 10μl PI，避光孵育 15 分鐘；

d)   加 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 15min；

e)    加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min；

3)   每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上機(jī)檢測(cè)。

注意 a.  操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；

b.  操作時(shí)注意避光；

c.  反應(yīng)完畢后盡快檢測(cè)，最好在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

3、用單克隆抗體 APO2.7 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1)   放置 0.5~1× 106 個(gè)細(xì)胞到試管中；

2)    室溫離心 200g ，6min；

3)    棄上清 ，加入 100μl 冷的（4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml  的 digitonnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育 20min；

4)   加入 2ml 冷的（4℃) PBSF 液，室溫離心 200g ，6min；

5)    棄上清， 加入 20μl PE 標(biāo)記的 Apo2.7  單克隆抗體和 80μl PBSF 液，用 vortex 輕輕震蕩，室溫避光孵育 15 分鐘；

6)   加入 2ml PBSF 液，室溫離心 200g ，6min；

7)    棄上清，加入 1ml PBSF 液重懸細(xì)胞；

8)   避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

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